전체 글25 NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 심화용 (3) | 2 | 라이브러리 제작Library Preparation 가. 말단수리 - End Repair 분절화가 끝난 핵산은 말단 부위가 완전히 이중나선(duplex) 구조로 되어 있지 않는 경우가 많다. 이러한 불완전한 말단을 DNA 중합효소 등을 이용하여 절단해 내거나 상보적인 염기로 채워 끝까지 완전히 이중나선 구조가 되도록 만들어 준다. 이 때 5′-말단에 인산기를 추가로 붙여 준다. 나. 3′-말단 아데닌 추가 - A-tailing 말단 수리된 DNA의 3′-말단에는 효소를 이용하여 아데닌(adenine) 염기를 추가하여 주면 아데닌이 튀어나와 걸쳐있는(overhang)형태를 가지게 된다. 이러한 산물은 티민(thymine)이 걸쳐있는 어댑터(adapter) 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합하기 쉽.. 2022. 8. 9. NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 심화용 (2) | 2 | 써모피셔사이언티픽 Thermo Fisher Scientific 장비 써모피셔사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) 사의 장비는 인수하기 전 처음 개발한 회사인 Ion Torrent 장비로 더 널리 알려져 있다. 이 장비는 라이브러리를 만든 후 이것을 미세한 비드(bead)에 붙여 증폭한다. 증폭된 라이브러리가 부착된 비드는 촘촘한 미세 구멍(well)에 하나씩 들어가도록 하고 각 구멍 밑에는 전류를 측정할 수 있는 반도체 칩 회로가 설계되어 있다. 각 구멍에 DNA 중합효소와 dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 염기를 순차적으로 넣어 주면 라이브러리 서열에 상보적인 염기가 결합하는 합성 과정에서 방출되는 수소이온(H+)으로 인하여 pH가 낮아지는 것을 반도체칩의 센서가.. 2022. 8. 9. NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 심화용 (1) 1. NGS의 개요 DNA의 염기서열에는 개인의 형질 및 질병과 관련된 유전적 정보가 저장되어 있으며 이를 분석하는 것은 생물학적 현상 및 질병의 발생 기전을 이해하고 진단 및 치료에 활용하는 데 중요하다. 염기서열을 분석하는 데에는 1970년대 Sanger에 의해 개발된 직접염기서열분석 방식이 전통적으로 널리 쓰였고 이는 DNA 복제효소(polymerase)가 DNA를 합성하는 과정에서 DNA 가닥을 계속 합성되도록 하는 디옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide, dNTP)와 DNA 가닥이 합성 도중 중단되도록 하는 디디오식뉴클레오티드(dideoxynucleotide, ddNTP)를 적절한 비율로 섞어주어 무작위적으로 다양한 길이의 DNA 합성 조각(fragment)들이 만들어지도록 하여 이를 전.. 2022. 8. 9. NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 입문용 (5) 8) RNA 시퀀싱 - RNA-sequencing, RNA-Seq RNA 가닥을 NGS에 적합한 라이브러리를 만들어 시퀀싱을 하는 것을 RNA 시퀀싱(RNA sequencing, RNA-Seq)이라 부른다. RNA 시퀀싱으로 단백질을 합성하는 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현(expression)과 일부 돌연변이를 확인할 수 있으며, 이외에 단백질을 합성하지 않는 논코딩(non-coding) RNA도 검사가 가능하다. 논코딩 RNA 중 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)와 같이 20 bp 내외의 작은 크기의 RNA도 NGS로 효과적으로 검사가 가능하며 이것을 small RNA-Seq이라 부른다. 또한 NGS를 이용한 전사체 RNA 분석을 하면 융합유전자(fusion .. 2022. 8. 9. NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 입문용 (4) 3) 단일염기다형성SNP 검출 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphisms, SNP)이란 정상인에서 관찰될 수 있는, 대개는 단백질의 기능이나 건강에 큰 영향을 미치지 않는 염기 한두 개 정도의 변화로서 유전체 전 범위에 분포하며 평균적으로 1,000개 염기(base-pair)마다 하나씩 존재한다. 몇몇 SNP 들은 특정 약물의 대사와 연관이 있기도 하고 특정 질환의 위험도를 예측하는데 연관분석(association study)을 통해 질환의 발생과 통계적 연관성이 확인되어 심혈관 질환, 당뇨병, 암과 같은 복잡한 질환의 기전을 연구하는데 도움이 되기도 한다. 또한 SNP도 개인식별에 이용될 수 있으며 50개 정도 이상의 SNP를 이용하면 대부분의 사람을 구분할 수 있게 되며 .. 2022. 8. 9. NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 입문용 (3) 5. NGS 결과 해석 및 보고 NGS에서 발견된 수많은 변이 중에서 환자의 질환과 연관이 있는 변이를 찾아내고 이를 최종적으로 해석하여 보고하는 것은 NGS 검사에서 가장 중요한 단계이지만 여러 의학적 근거와 환자의 임상양상을 토대로 판단해야 하기 때문에 가장 어려운 단계이기도 하다. 정확하고 객관적인 보고를 위해 이에 미국의학유전학회(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)에서는 선천성 생식세포(germ-line) 돌연변이 해석 기준을 제시하였다. 여기에서는 여러 가지 근거를 참고로 하여 5단계로 분류하여 보고하도록 하고 있다. 암 체세포 돌연변이는 미국 분자병리학회(Association for Molecular Pathology, AMP).. 2022. 8. 9. 이전 1 2 3 4 5 다음
