NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 심화용 (9)

| 1 | 생식세포 돌연변이Germ-line mutation

 

1) 생식세포 변이 해석 가이드라인

NGS의 발전으로 인해 유전 질환과 관련된 유전자의 새로운 변이의 발견이 급격히 증가함에 따라 환자의 표현형(phenotype)과 유전형(genotype)의 연관성을 해석하는 기준에 대한 표준화의 필요성이 높아졌다. 이에 미국의학유전학회(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)와 분자병리학회(Association for Molecular Pathology, AMP)에서 염기서열검사에서 발견된 변이의 해석을 위한 기준 및 가이드라인을 2015년에 발간한 바 있으며, 현재 이 가이드라인은 생식세포변이 분석에 표준으로 널리 사용되고 있다.

 

2) 변이의 분류

ACMG 가이드라인에서는 병원성에 대한 근거의 수준 및 개수에 따라 병원성의(Pathogenic)/병원성이 의심되는(Likely pathogenic)/임상적 의미가 불명확한(Uncertain significance)/양성이 의심되는(Likely benign)/양성의(Benign) 5단계로 분류하여 판정한다. 이러한 판정은 해당 변이의 병원성을 시사하는 근거와 양성을 시사하는 각종 근거들을 종합한 후 충분한 정도의 근거가 확보될 때 판정하게 된다.

그림 37. ACMG 가이드라인 변이 분류의 5단계

표 17. 병원성(Pathogenic) 변이를 시사하는 근거

 

그림 38. 정지 변이(Null variant, PVS1)에 해당하는 넌센스(nonsense), 틀이동(frameshift), 스플라이싱(splicing) 및 엑손 결손 (exon deletion) 변이

표 18. 양성(Benign) 변이를 시사하는 근거

 

3) 결과 보고서

간단하지만 이해가 쉬운 보고서가 효율적인 보고서이며 보고서에 포함될 수 있는 요소는 다음과 같은 것들이 있다. 보고서에는 검사 결과 및 방법에 대한 정확한 기술과 함께 검사 결과가 환자의 진단 및 치료에 가질 수 있는 의미에 대해서 자세한 기술이 필요하다. 또한 검사의 검출 범위 및 제한점에 대해서 기술함으로써, 검사를 통해서 질환 관련 돌연변이를 검출하지 못할 수 있는 가능성에 대해 임상의사 및 환자가 충분히 인지하도록 한다.

표 19. NGS 결과 보고서의 포함 내용

그림 39. NGS 결과 보고서의 예시

 

 

| 2 | 암 체세포 돌연변이

 

1) 조직병리 정보의 중요성

체세포 돌연변이는 해당 종양이 발생한 원발 장기 및 조직학적 유형에 따라 빈번하게 발생하는 돌연변이의 종류가 다르므로, 검사가 진행된 해당 종양의 조직학적 진단을 반드시 확인해야 한다. 또한 해당 종양에서 이전에 시행하였던 단일 유전자 검사가 있을 경우 결과를 확인해야 한다. 여러 암종에서 표준 치료로 정립이 되어 있는 항암제의 경우 항암제 사용 여부를 결정하기 위하여 진단과 동시에 단일 유전자 검사가 진행되는 경우가 흔하다. 예를 들어 4기 폐암의 경우 신속한 항암제 결정을 위하여 조직학적 진단과 동시에 EGFR 돌연변이, ALK 유전자 재배열 등에 대한 검사가 진행이 된다. 유방암의 경우 estrogen-receptor(ER), progesterone-receptor(PR) 수용체의 발현 여부 및 HER2 유전자의 증폭 여부 등에 대한 검사가 진행이 된다. 이러한 선행 유전자 검사 결과는 해당 암종의 분자-유전자 아형을 결정 지으므로 NGS 검사 결과를 해석할 때에 반드시 참조해야 한다.

해당 검체에서 종양세포 비율(tumor purity)을 조직학적으로 확인하는 것은 중요하며 종양세포 비율이 낮으면 민감도가 높지 않은 검사에서는 돌연변이를 놓칠 수 있는 가능성이 있으며 NGS 분석 결과에서 variant allele frequency(VAF), fusion read count, estimated copy number 등의 지표에 영향을 미치므로 결과 해석에 반드시 참조해야 한다. 검출할 수 있는 VAF의 한계(detection limit)가 5%로 정립되어 있을 경우 이론적으로 종양세포 비율이 10% 이상인 검체가 권장된다. 또한 일반적으로 종양세포 비율이 20% 이상일 경우, 유전자복제수(copy number variation, CNV) 분석 결과에 대한 신뢰가 높은 것으로 알려져 있다.

 

2) 검출된 유전자 변이 확인

체세포 돌연변이는 종양세포 비율 및 종양내 이질성(heterogeneity) 때문에 돌연변이 비율이 적게는 1% 미만에서 많게는 90% 이상까지 다양하게 나온다. 낮은 레벨의 돌연변이를 검출하기 위해서 에러를 제거하는 단계가 필요하며 VCF 파일의 여러 질 관련 파라미터를 확인하고 IGV 등 시각화 프로그램으로 확인할 필요가 있으며, 필요에 따라 다른 검사법으로 검증해야 할 경우도 있다.

종양에서 발생한 유전자 변이는 일차적으로 체세포변이를 중심으로 살펴보므로, 기존 데이터베이스에서 정상인에서 발견될 수 있다고 보고된 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)은 제거하고 분석해야 한다. 암환자에게서 시행하는 대부분의 NGS 검사는 비용 등의 문제로 인하여 해당 환자의 정상 세포(matched control)에 대한 시퀀싱은 이루어지지 않는다. 따라서 같은 환자 내에서 체세포와 생식세포 변이에 대한 직접적인 비교가 어려우므로 주의가 요구된다.

각 장기 별로 반드시 체크해야 하는 필수유전자(white gene list) 목록을 작성하고 검토하는 것이 도움이 되고, 필수유전자 리스트는 해당 암종에서 표준치료 또는 현재 강력하게 제안되는 항암제 등의 사용여부를 결정하는데 있어 기준이 되는 유전자 및 빈도가 높다고 알려진 유전자를 대상으로 한다. 예를 들어 폐암의 경우 EGFR, KRAS, ALK, ROS1, BRAF, ERBB2, RET 등이 해당된다. 또한 항암제에 대한 내성이 의심될 경우 내성 기전과 관련된 유전자 변이(예. EGFR 표적 치료제 내성과 관련된 EGFR T790M 변이)도 점검해야할 필수유전자 혹은 돌연변이에 포함된다. 항암치료와 연관된 유전자 변이는 대부분 아미노산 변화를 일으키는 비동일(non-synonymous) 돌연변이이므로 엑손(exon) 부위의 유전자 변이를 집중적으로 검색할 수 있다.

 

 

 

출처: 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 - 차세대염기서열분석 해설서