NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 심화용 (11)

| 4 | NGS 검사 전 검증validation

 

NGS 검사를 실시하기 전 검증(validation) 혹은 확인(verification)이 필요하며 검사 도입 후에도 지속적인 검증이 필요하다.

 

1) 성능평가

미국 Clinical Laboratory Improvement Amendments(CLIA) 권고사항에 따르면, NGS 분석적 성능 평가는 정확도(accuracy), 정밀도(precision), 분석적 민감도(analytical sensitivity), 분석적 특이도(analytical specificity), 보고가능 범위(reportable range), 참고 범위(reference interval, normal value), 검출한계(limit of detection) 등을 포함한다.

 

가. 정확도 Accuracy

표준방법으로 측정된 값과 비교 평가를 수행하거나, 국내외의 공인된 기관에서 운영하는 외부정도관리 프로그램(숙련도평가)에 참여한다.

 

나. 정밀도 Precision

NGS 검사는 정성검사로 검사의 재현성 평가를 통해 정밀도를 평가할 수 있으며 여기에는 참값을 알고 있는 표준물질(예. NA12878) 또는 환자 검체(예. 직접염기서열분석법으로 확인된 돌연변이를 포함한 임상 검체)가 포함될 수 있다. 이것은 일정한 기간 동안 반복 측정하여 평가할 수 있다.

 

다. 분석적 민감도 Analytical sensitivity 및 분석적 특이도 analytical specificity

분석능 평가 검체로 역시 표준물질이나 환자 검체를 사용할 수 있다. 가이드라인에 따른 검체 수를 이용하여 평가하는 것이 좋으나 충분한 수의 검체수가 없을 경우 추후 지속적 검증(ongoing validation)을 할 수 있다. 민감도는 타겟 부위의 표준물질의 총 변이 중 몇 개의 변이를 검출하는지로 측정이 되며 특이도는 변이가 없는 부위에서 변이를 발견하지 않는 비율로 구할 수 있다.

라. 보고가능 범위 Reportable range

NGS 검사의 성능을 검증하였으면 정확도가 확보된 부위와 관련된 유전자 정보, 해당 유전자의 표적 엑손(exon) 및 보고 가능한 인트론(intron) 범위, 보고 가능한 변이의 종류(예. single nucleotide variant, heterozygous or homozygous variant 등)를 규정하고, 타당한 기준에 의해 선정된 정상인에서 측정된 결과값을 근거로 참고범위(reference interval, normal limit)를 설정할 수 있다.

 

마. 검출 한계 Limit of detection

NGS 검사는 정성검사로서 낮은 농도의 변이가 필요한 검사, 예를 들어 암에서의 체세포 돌연변이(somatic mutation), 미토콘드리아 이종성체(mitochondrial heteroplasmy) 혹은 모자이시즘(mosaicism)의 경우에 검출 한계의 검증이 필요하다.

2) 생물정보학 파이프라인 Bioinformatics pipeline 평가

생물정보학 파이프라인은 검사 목적, 검체의 종류 및 NGS 검사로 검출하고자 하는 변이의 종류에 적합한 검증이 되어야 한다. 검사 전 검증은 실제 사용하는 검사법과 동일하게 수행되어야 하며 그 이후에도 주기적으로 모니터링하고 실험과정 변경 사항 및 플랫폼, 시약에 업그레이드 등의 변경사항이 있을 때에는 이를 재검증해야 한다. 검증 사항에는 질 평가 지표(metrics) 및 정도관리 변수(QC parameters)에 대한 기준을 충족하는지 여부, 검체 혼합(pooling) 후 NGS 검사 시행 시 검사 대상자 검체 간의 오염 없이 결과가 산출되는지 여부, 표적부위와 상동성이 높은 부위(예. pseudogene)에 의한 간섭반응 여부 등이 포함된다.

 

2) 생물정보학 파이프라인 Bioinformatics pipeline 평가

생물정보학 파이프라인은 검사 목적, 검체의 종류 및 NGS 검사로 검출하고자 하는 변이의 종류에 적합한 검증이 되어야 한다. 검사 전 검증은 실제 사용하는 검사법과 동일하게 수행되어야 하며 그 이후에도 주기적으로 모니터링하고 실험과정 변경 사항 및 플랫폼, 시약에 업그레이드 등의 변경사항이 있을 때에는 이를 재검증해야 한다. 검증 사항에는 질 평가 지표(metrics) 및 정도관리 변수(QC parameters)에 대한 기준을 충족하는지 여부, 검체 혼합(pooling) 후 NGS 검사 시행 시 검사 대상자 검체 간의 오염 없이 결과가 산출되는지 여부, 표적부위와 상동성이 높은 부위(예. pseudogene)에 의한 간섭반응 여부 등이 포함된다.

 

 

| 5 | NGS 검사의 질 관리 지표

 

NGS 검사의 모든 단계, 즉 라이브러리 제작, 시퀀싱 단계, 데이터 분석 단계에 대한 정도관리 지표를 확인하고 설정 범위에 벗어났을 경우 적절한 정도 관리가 필요하다.

 

1. 실험 단계의 정도관리

1) 샘플 정도관리

실험단계에서는 검체의 질 관리가 먼저 필요하며 검체로부터 추출한 DNA(genomic DNA)는 DNA 농도, 순도(purity), 조각의 길이 등을 확인하여야 하고 RNA를 추출했을 경우 RNA 농도, 순도 및 완전성 여부(RNA integrity number, RIN) 등을 측정해서 검사실이 설정한 기준에 부합하지 않을 때 원인을 분석하고 적절한 수정조치를 시행하여야 한다.

그림 41. RNA integrity number(RIN) 예시. 질이 좋은 샘플(좌) 및 손상이 많이된 샘플(우)

 

2) 라이브러리 정도관리

NGS를 진행하기 전에는 제작된 라이브러리가 적합한지 확인하는 정도관리(quality control) 단계가 필요하며 여기에는 형광을 이용한 DNA 라이브러리 농도 측정(예. Qubit 장비), 전기영동을 이용한 DNA 농도와 크기 측정(예. TapeStation 장비) 혹은 어댑터에 특이적인 프라이머를 이용한 실시간 정량(real-time quantitative) PCR 법을 이용한 어댑터 부착 여부를 확인하는 방법 등이 이용된다.

그림 42. 라이브러리 정도관리를 위한 전기영동법(상)과 정량 PCR(하)

그림 43. Q30(Phred score>30) 수치

 

그림 44. 일루미나 장비의 클러스터 밀도(cluster density)

 

 

 

출처: 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 - 차세대염기서열분석 해설서