NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 입문용 (5)

8) RNA 시퀀싱 - RNA-sequencing, RNA-Seq

RNA 가닥을 NGS에 적합한 라이브러리를 만들어 시퀀싱을 하는 것을 RNA 시퀀싱(RNA sequencing, RNA-Seq)이라 부른다. RNA 시퀀싱으로 단백질을 합성하는 메신저 RNA(messenger RNA, mRNA)의 발현(expression)과 일부 돌연변이를 확인할 수 있으며, 이외에 단백질을 합성하지 않는 논코딩(non-coding) RNA도 검사가 가능하다. 논코딩 RNA 중 마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)와 같이 20 bp 내외의 작은 크기의 RNA도 NGS로 효과적으로 검사가 가능하며 이것을 small RNA-Seq이라 부른다. 또한 NGS를 이용한 전사체 RNA 분석을 하면 융합유전자(fusion gene)를 검출할 수 있고 예상하지 않았던 재조합 유전자나 절단점(breakpoint)을 가진 재조합도 검출할 수 있다.

RNA는 변성되기 쉽기 때문에 라이브러리를 제작할 때에는 RNA에 상보적인 DNA(complementary DNA, cDNA)로 합성하는 과정이 필요하다. cDNA가 만들어진 후에 진행되는 라이브러리 제작과 시퀀싱 단계는 DNA 시퀀싱과 동일 하다.

 

9) DNA 메틸화 - methylation

DNA 메틸화(methylation)은 후성유전학적(epigenetic) 변화 중 대표적인 것으로서 주로 사이토신(cytosine)의 5번 탄소에 메틸기(-CH3)가 붙어 5-methylcytosine 형태로 변형되는 것이다. DNA 메틸화의 이상이 생기면 프레더윌리(Prader-Willi) 증후군, 엔젤만(Angelman) 증후군과 같은 유전성 질환을 일으킬 수 있다. 암세포에서는 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)의 프로모터 부위가 비정상적으로 과메틸화(hypermethylation)되어 유전자의 발현(expression)을 억제시켜 암 발생에 영향을 주거나, 암 활성화 유전자(proto-oncogene)의 저메틸화(hypomethylation)가 일어나 유전자의 발현이 증가하여 또한 암 발생을 촉진시킬 수도 있다.

그림 19. DNA 메틸화(methylation)와 유전자 발현 변화

 

10) Chromatin immunoprecipitation(ChIP) 시퀀싱

Chromatin immunoprecipitation(ChIP)은 살아있는 세포에서 특정 단백질이 결합하는 DNA 부분을 해당 단백질의 항체를 이용해 선택적으로 농축하는 실험 방법으로 단백질과 DNA의 상호작용을 분석하는데 활용될 수 있다. ChIP sequencing(ChIP-Seq)은 농축된 단백질에 결합된 DNA를 추출하여 NGS를 통해 분석하는 방식으로 시퀀싱 깊이(depth)가 높게 나오는 부위가 해당 단백질의 결합부위(binding site)라 추측해볼 수 있다. ChIP-Seq 법으로 분석할 수 있는 단백질에는 전사 조절 인자(transcript factor), 활성자(activator), 억제자(repressor), 구조 단백질 등이 있으며, 결합부위 분석을 통해 전체 유전체에서 그들의 새로운 타겟 위치를 찾거나 결합부위의 염기서열을 분석하여 해당 단백질이 인식하는 염기서열 모티프(motif )를 찾을 수도 있다.

그림 20. ChIP-Seq 과정

 

11) 단일세포 시퀀싱 - Single cell sequencing

단일세포 시퀀싱(Single cell sequencing)은 세포 하나하나의 유전체를 분석하는 방법으로 세포마다 다른 고유한 유전적 변이를 규명할 수 있다. 특히 순환종양세포(circulating tumor cell), 종양 생검 조직(tissue biopsy), 줄기세포(stem cell) 등과 같이 샘플의 양이 적은 경우나 다양한 클론(clone)을 규명하는 것이 중요할 때 사용될 수 있으며, 전장 유전체 시퀀싱뿐 아니라 전사 유전체와 후성유전체 등 다양한 방법을 이용하여 연구할 수 있다. 가장 많이 사용하는 microdroplets 법은 세포들이 미세한 방울에 하나씩 들어가도록 자동조정되고 이후의 모든 라이브러리 제작 반응이 그 안에서 일어나는 방식이며, 각각의 방울에 있는 세포를 구분하기 위해 방울 안에 있는 라이브러리는 서로 다른 분자바코드(unique molecular identifier, UMI)로 구분된다.

 

12) 미생물 분야에서 NGS 활용

NGS 검사는 병원균의 완전한 유전체 정보를 얻을 수 있기 때문에 병원균의 내성 및 독성 관련 돌연변이 혹은 유전형에 대한 정보를 얻을 수 있으며, 유전체 정보로 병원균의 발병(outbreak)에 대한 역학(epidemiology) 조사를 할 수 있다. 메타지놈(metagenome) 분석을 통해 배양을 하지 않고 원래의 검체 안의세균들의 조성을 확인할 수 있으며, 특히 세균은 16S 유전자가 공통적으로 존재하지만 균종 별로 다양성이 크기 때문에 이를 증폭하여 NGS 분석을 함으로써 손쉽게 균종 분포 정보를 얻을 수 있다.

미생물은 표준 염기서열이 없는 경우가 많기 때문에 시퀀싱 리드를 조합하여 균의 염기서열을 추정하는 새로운 조립(de novo assembly) 알고리즘을 사용한다. 여기에는 짧은 DNA 조각의 염기서열 정보를 묶어 이어 붙이는 과정이 필요한데 일루미나(Illumina) 장비와 같이 짧은 시퀀싱 리드를 가진 장비에서 얻은 데이터는 각 염기의 정확도는 높으나 새로운 조립 과정에서 컨티그끼리 이어지지 않는 부위가 생길 가능성이 높은 반면 옥스포드 나노포어(Oxford Nanopore) 혹은 퍼시픽바이오사이언스(Pacific Biosciences) 등 3세대 장비는 개별 염기의 정확도는 떨어지지만 긴 시퀀싱 리드를 생산하기 때문에 틈이 없이 컨티그를 만드는 데 유리하다.

그림 21. 새로운 조립(de novo assembly)에서 짧은 리드와 긴 리드의 장단점

 

단일 균주가 아닌 여러 균주의 분포 상태를 보는 것을 메타지놈(metagenome) 분석이라 하고, 미생물을 배양하지 않고 샘플에서 직접 DNA를 추출하고 샘플 안에 있는 전체 균주의 유전정보를 획득하는 방법으로 배양이 불가능한 균도 확인할 수 있고 군집의 미생물 구성적 특성을 알게 됨에 따라 질병 또는 환경과의 연관성을 연구할 수 있다. 메타지놈 분석에는 16S 리보좀 RNA(rRNA) 분석을 많이 이용하고 있는데 이 유전자는 약 1500 bp 정도의 크기이며, 여기에는 균종마다 다르고 변동성(variability)이 큰 부위(variable region)가 존재한다. 이러한 변동성 부위 사이에는 균종에 상관없이 염기서열이 동일한 부위(constant region)가 존재하는데 이 부위에 맞추어 모든 균이 공통적으로 증폭될 수 있는 프라이머(universal primer)를 고안하여 PCR 증폭을 하여 NGS 분석을 할 수 있다.

그림 22. 16S rRNA의 변동성 부위(V1-V9)와 변함없는 부위(회색)

 

NGS는 한번에 많은 타겟을 분석할 수 있다는 장점 때문에 다양한 종류 혹은 미지의 바이러스를 검출하는데 이용될 수 있다. 또한 항생제 및 항바이러스제 치료에 대한 내성과 관련된 돌연변이를 효과적으로 검출할 수 있다.

 

8. 향후 전망

NGS 기술이 도입되면서 염기서열 분석은 비약적인 발전을 하였으며 다양한 유전정보를 정확하게 얻음으로써 질환의 원인 규명과 환자의 진단에 큰 도움을 받고 있다. 하지만 NGS 결과 발견된 수많은 유전 변이의 임상적 의미에 대한 해석이 큰 숙제가 되고 있으며 환자들에 대한 결과에 대한 설명과 유전상담도 점차 중요해지고 있다. 또한 대량의 데이터의 분석, 저장, 해석 등의 중요성이 훨씬 커지고 있으며, 딥러닝(deep learning), 블록체인(blockchain) 등 새로운 데이터 분석 및 교환 기법이 시도되고 있어 앞으로 4차 산업혁명과의 접목이 확대될 것으로 예상된다.

 

 

출처: 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 - 차세대염기서열분석 해설서