NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 심화용 (2)

| 2 | 써모피셔사이언티픽 Thermo Fisher Scientific 장비

써모피셔사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) 사의 장비는 인수하기 전 처음 개발한 회사인 Ion Torrent 장비로 더 널리 알려져 있다. 이 장비는 라이브러리를 만든 후 이것을 미세한 비드(bead)에 붙여 증폭한다. 증폭된 라이브러리가 부착된 비드는 촘촘한 미세 구멍(well)에 하나씩 들어가도록 하고 각 구멍 밑에는 전류를 측정할 수 있는 반도체 칩 회로가 설계되어 있다. 각 구멍에 DNA 중합효소와 dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 염기를 순차적으로 넣어 주면 라이브러리 서열에 상보적인 염기가 결합하는 합성 과정에서 방출되는 수소이온(H+)으로 인하여 pH가 낮아지는 것을 반도체칩의 센서가 탐지하고 분석하는 방식이다. 현재 출시된 장비로는 Ion Personal Genome Machine(PGM) 및 Ion S5 System 두 가지 종류가 있다.

그림 5. 써모피셔사이언티픽 장비의 원리 및 종류

 

| 3 | 퍼시픽바이오사이언스 Pacific Biosciences 장비

퍼시픽바이오사이언스(Pacific Biosciences) 사는 SMRT(Single Molecule, Real-Time) 기술을 이용하고 있으며, 이는 긴 샘플 DNA를 PCR 증폭 없이 그대로 장비의 작은 구멍에 하나씩 넣어서 실시간으로 DNA 염기서열을 분석하는 방식이다. 장비의 작은 구멍의 바닥에는 각각 DNA 중합효소가 부착되어 있으며 각기 다른 형광이 부착된 dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 염기를 샘플 DNA와 함께 넣어 주면 상보적인 염기가 삽입될 때마다 발생하는 반응을 형광 강도 변화로 검출하여 실시간으로 염기서열을 측정하는 방식이다. 현재는 새로운 세대인 Sequel 장비가 출시되어 있다.

그림 6. 퍼시픽바이오사이언스 장비의 원리 및 종류

 

| 4 | 옥스포드나노포어 Oxford Nanopore 사

옥스포드나노포어(Oxford Nanopore) 사의 기술은 나노 크기(nano-scale)의 구멍(pore)에 한 가닥의 DNA가 통과하면서 발생하는 각 염기서열에 따른 전위 변화를 분석하는 방식이다. DNA와 효소가 결합된 복합체는 얇은 막 위에 있는 모터 단백질(motor protein)에 붙고 외핵산분해효소(exonuclease)가 이중나선(double-stranded) 구조의 DNA 끝에 결합하여 단일가닥(single-strand) DNA를 만들어내고, 만들어진 단일가닥 DNA는 막 단백질의 구멍을 통과하면서 전기신호를 발생하게 되어 이를 칩에서 측정을 하여 염기서열을 판독하는 장비이다. 옥스포드나노포어 사에서는 장비가 따로 없이 칩(chip)만 판매하고 있으며, 이 칩을 USB 포트를 이용하여 전용 소프트웨어가 설치된 컴퓨터에 연결하면 컴퓨터에서 직접 데이터를 수집하고 기록하는 방식으로 되어 있다.

그림 7. 옥스포드나노포어의 원리 및 칩 종류

 

| 5 | 각 장비의 장단점

각 NGS 장비마다 원리가 다르기 때문에 장단점이 다르며 일반적으로 일루미나, 써모사이언티픽 등 2세대 장비는 정확도가 높은 반면 시퀀싱 길이가 짧아 점돌연변이 검출에 유리하고 구조적 변화를 검출하는 데는 취약하다. 반대로 퍼시픽바이오사이언스, 옥스포드나노포어 등 3세대 장비는 정확도는 낮은 반면 시퀀싱 길이가 길어 점돌연변이 검출보다는 구조적 변화를 검출하거나 표준 염기서열이 없는 미생물 등에서 새로운 조립(de novo assembly)을 할 때 유리하다.

표 2. 각 NGS 장비의 장단점

 

3. NGS 전처리 과정

 

NGS 전처리 과정은 샘플 DNA 혹은 RNA가 NGS 장비에서 인식하여 염기서열분석을 할 수 있도록 가공하는 과정이다. NGS 장비가 인식하기 위해서는 보통 샘플 DNA 혹은 RNA를 적당한 크기로 자른 후 양 끝에 특정한 염기서열을 가진 어댑터(adapter) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 붙여준다. 이렇게 만들어진 산물을 라이브러리(library)라고 부른다.

그림 8. 라이브러리의 구조, 일루미나(상) 및 써모피셔사이언티픽(하)

 

라이브러리 제작은 분절화(fragmentation), 말단수리(end-repair), 3′-말단 아데닌 추가(A-tailing), 어댑터 부착(adapter ligation), 라이브러리 증폭(library amplification)으로 나누어진다. 이러한 과정에서 필요한 구성품들을 하나의 세트로 구성한 상용화된 제품들이 현재 활발히 출시되고 있으며, 일루미나, 써모사이언티픽, NEB 등 글로벌 기업의 제품과 함께 디엑솜(Dxome) 등 국내 기업 제품들이 NGS 검사실에서 사용되고 있다.

 

| 1 | 분절화Fragmentation

샘플에서 추출된 핵산은 NGS 장비에서 분석 가능한 크기로 적절하게 절단시켜야 한다. 이것을 분절화(fragmentation)라 부르고 물리적 또는 효소적인 방법으로 무작위로 절단을 일으킨다. 물리적 방법은 보통 장비에서 초음파를 발생시켜 생성되는 에너지를 이용하여 핵산을 절단하며, 발생되는 에너지와 노출되는 시간을 조정하여 분절화 길이를 조절할 수있다. 현재 Covaris, Diagenode 및 Qsonica 사의 장비들이 널리 이용되고 있다. 효소적 방법은 핵산을 무작위적으로 절단하는 nuclease, fragmentase, transposase 등의 효소를 적절한 조건에 처리를 하여 원하는 크기의 핵산 분절(fragment)을 얻는 방법이다.

그림 9. 물리적 분절화(상)와 효소적 분절화(하)

 

표 3. 물리적 분절화와 효소적 분절화의 장단점

 

 

출처: 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 - 차세대염기서열분석 해설서