NGS(Next Generation Sequencing) 기반 유전자 검사의 이해 - 심화용 (1)

1. NGS의 개요

 

DNA의 염기서열에는 개인의 형질 및 질병과 관련된 유전적 정보가 저장되어 있으며 이를 분석하는 것은 생물학적 현상 및 질병의 발생 기전을 이해하고 진단 및 치료에 활용하는 데 중요하다. 염기서열을 분석하는 데에는 1970년대 Sanger에 의해 개발된 직접염기서열분석 방식이 전통적으로 널리 쓰였고 이는 DNA 복제효소(polymerase)가 DNA를 합성하는 과정에서 DNA 가닥을 계속 합성되도록 하는 디옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide, dNTP)와 DNA 가닥이 합성 도중 중단되도록 하는 디디오식뉴클레오티드(dideoxynucleotide, ddNTP)를 적절한 비율로 섞어주어 무작위적으로 다양한 길이의 DNA 합성 조각(fragment)들이 만들어지도록 하여 이를 전기영동(electrophoresis)으로 조각의 크기를 구분하는 방식이다. 근대식 장비는 ddNTP 염기에 형광을 붙여 미세관에 전기영동(capillary electrophoresis)을 하여 레이저로 검출하는 기능을 갖추어 더욱 정교하고 정확한 염기서열 분석이 가능하게 하였다.

그림 1. 직접염기서열분석법의 원리

 

이러한 직접염기서열분석 방식은 수십년 동안 염기서열의 표준 방식으로 이용되었으며, 1990년 초에 시작하여 2000년 초에 완성된 인간 게놈 프로젝트(Human genome project)에 사용되기도 하였다. 그러나 이 방식은 분석하고자 하는 부위를 PCR 증폭해야 하기 때문에 여러 타겟을 분석할 경우 많은 시간과 노력 및 비용이 소요되어 효율이 낮은 문제점이 있었다. 이러한 단점을 극복하고자 차세대 염기서열분석(Next generation sequencing; NGS) 법이 개발되었으며 이것은 DNA 가닥을 각각 하나씩 분석하는 방식으로 기존의 직접 염기서열분석법에 비해 매우 빠르고 저렴하게 염기서열 분석이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 기존의 직접염기서열분석방식을 이용한 인간게놈프로젝트는 수십억 달러가 소요되었지만, 2008년에는 새로 개발된 NGS를 이용하여 인간게놈프로젝트와 비슷한 정도의 결과를 짧은 시간에 훨씬 저렴한 비용으로 수행할 수 있었다. NGS는 DNA 를 일정한 조각(fragment)으로 분절화시키고 장비가 인식할 수 있는 특정 염기서열을 가진 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 붙여주는 라이브러리(library)제작, 각 라이브러리 DNA 가닥의 염기서열을 장비에서 읽는 단계, 그리고 장비에서 생성된 데이터를 가공하여 알고리즘으로 분석하는 단계로 구성된다.

그림 2. NGS의 개념 및 단계

그림 3. NGS 진행 과정(workflow)

 

2. NGS 장비의 종류

 

NGS 장비는 2004년 최초로 상용화된 후 현재까지 그 성능이 비약적으로 발전하고 있다. 주요 NGS 플랫폼들은 각자 고유한 특성을 지니고 있고 플랫폼 및 기술, 가격까지 경쟁적으로 향상시키고 있으며, 일루미나(Illumina), 써모피셔사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 퍼시픽바이오사이언스(Pacific Biosciences), 옥스포드나노포어(Oxford Nanopore Technologies) 등의 회사에서 출시된 제품들이 관련 시장을 형성하고 있다.

현재 시장에서는 일루미나와 써모피셔사이언티픽 사의 2세대 시퀀서가 주를 이루고 있다. 이들은 짧은 DNA 가닥을 만들어 빠른 속도로 저렴하고 정확하게 염기서열 분석을 하여 점돌연변이(point mutation)와 같은 작은 수준의 유전자 변화를 검출할 수 있는 장점이 있다. 퍼시픽바이오사이언스, 옥스포드나노포어 등의 3세대 장비들은 2세대 장비의 짧은 분석범위의 단점을 보완한 것으로서 PCR 증폭 과정이 없이 DNA 단일분자를 실시간(real-time)으로 읽어 매우 긴 DNA 가닥의 염기서열을 한번에 읽을 수 있다는 장점이 있으나 개별 염기서열 측면에서 보면 정확도가 높지 않아 아직은 연구용으로 더 많이 사용되고 있다. 최근 3세대 시퀀서 장비의 정확도가 점점 향상되고 있어 임상진단에 활용이 시도되고 있다.

표 1. 2010년 이후 주요 NGS 회사의 플랫폼 변화

 

| 1 | 일루미나Illumina 장비

일루미나(Illumina) 사의 기술은 DNA 가닥을 복제 혹은 합성하면서 염기서열을 분석하는 sequencing by synthesis 방식의 일종이다. 이 장비에서는 단편화된 샘플 DNA에 장비가 인식할 수 있는 어댑터(adapter) 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 결합시킨 라이브러리(library)를 유리판에 부착된 탐침자(probe)에 결합시키키고, 결합된 각 라이브러리를 증폭(bridge amplification)하여 각 DNA 단편에 대한 클러스터(cluster)를 만든다. 여기에 각기 다른 형광이 부착된 염기(dATP, dCTP, dTTP, dGTP)와 함께 DNA 중합효소(polymerase)를 넣어 주면 각 클러스터에는 라이브러리의 DNA의 염기서열에 상보적인 염기가 삽입되면서 각기 다른 형광을 방출하게 된다. 염기 하나가 삽입될 때마다 방출된 형광은 장비에 부착된 CCD 카메라로 사진을 찍고, 장비는 형광이 발생된 클러스터의 위치를 기억하고 있다가 각 클러스터의 형광 변화를 감지하여 클러스터의 염기서열을 기록한다. 출시된 장비로는 iSeq, MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, NovaSeq 등이 있으며 열거된 순서에 따라 출력(output)이 높아져 대량의 데이터를 생산할 수 있다.

그림 4. 일루미나 장비의 원리 및 종류

 

출처: 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 - 차세대염기서열분석 해설서